Cre Recombinase, TAT-Cre (Tat-NLS-Cre, HTNC, HTNCre)

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Cre重組酶通?？s寫為Cre，是一種I型酶拓?fù)洚悩?gòu)酶來自P1噬菌體催化loxP位點間DNA的位點特異性重組。這種酶不需要任何能量輔因子Cre介導(dǎo)的重組底物和反應(yīng)產(chǎn)物之間迅速達(dá)到平衡。loxP識別元件是一個34堿基對(bp)序列，由兩個13 bp反向重復(fù)序列組成，側(cè)翼是一個8 bp間隔區(qū)，提供方向性。重組產(chǎn)物依賴于loxP位點的位置和相對方向。含有單個loxP序列的兩種DNA將會融合，而相同方向的loxP序列之間的DNA將以環(huán)狀形式被切除，相對的loxP序列之間的DNA相對于其余的DNA是反向的。

Cre重組酶被用作修飾基因和染色體的工具。在這種方法中，Cre重組酶用于在實驗動物中刪除LoxP位點側(cè)翼的DNA片段(也稱為“floxed")。在許多轉(zhuǎn)基因物種中，它已被用于產(chǎn)生具有僅限于某些細(xì)胞類型的突變(組織特異性敲除)的動物或具有可通過給藥激活的突變(誘導(dǎo)性敲除)的動物。具有組織特異性或可誘導(dǎo)的Cre表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系的可獲得性允許研究人員簡單地通過將固定的動物繁殖到預(yù)先存在的Cre轉(zhuǎn)基因動物來滅活或激活感興趣的基因。誘導(dǎo)型Cre重組酶系統(tǒng)的一個例子是Cre-ER (ER =雌激素受體蛋白)系統(tǒng)，其中腹腔內(nèi)注射關(guān)于三苯氧胺會引起取決于劑量的切除固定位點(即使選擇的基因失活)。

重組Cre重組酶(TAT-Cre)從攜帶工程質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中純化，所述工程質(zhì)粒編碼來自噬菌體P1的增強(qiáng)形式的Cre重組酶。這種Cre重組酶具有一個N-末端6XHis標(biāo)簽、一個Tat肽(GRKKRRQRRRPPAGTSVSL)和一個NLS序列(PKKKRKV)。與其它形式的Cre重組酶(例如HNC、TCH6、HC、HNCM、CH)相比，HTNC是轉(zhuǎn)導(dǎo)(體內(nèi))和隨后重組中*有效的蛋白質(zhì)。成纖維細(xì)胞報告細(xì)胞與1微米HTNC孵育1至2小時，可導(dǎo)致60 ~ 90%的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。向培養(yǎng)基中添加100微米氯喹可以進(jìn)一步增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)和重組。

應(yīng)用程序

• 用于亞克隆或載體/克隆工程的體外LoxP重組

• 體外轉(zhuǎn)導(dǎo)到包括干細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞中

性能：

濃度:2、5或10毫克/毫升。

分子量:43千道爾頓

QC: Tat-Cre在HEK293T- Cre報告細(xì)胞中誘導(dǎo)80~100%的重組效率。用報道質(zhì)粒DNA: LoxP-RFP-Stop-LoxP-GFP轉(zhuǎn)染HEK 293t-細(xì)胞，然后加入1個微米純化的Tat-Cre蛋白。

圖1: 0:添加Tat-Cre前；用Tat-Cre轉(zhuǎn)導(dǎo)后1至5天。

內(nèi)毒素水平:< 0.1歐盟單位/微克

通過SDS-PAGE和HPLC分析，純度> 98%。

單位定義：100單位的標(biāo)準(zhǔn)被定義為在HEK 293T報道細(xì)胞系分析中誘導(dǎo)50% GFP表達(dá)所需的1.0 mL組織培養(yǎng)基中TAT-CRE的量(μg)。

穩(wěn)定性：零下80度2年oC.零下20度6個月oC.最長3周，4oC

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