纖維素酶（CL）測(cè)試盒

微量法 100管/48樣

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

CL（EC 3.2.1.4）存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi)，能夠催化羧甲基纖維素降解，是一類可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、棉紡、環(huán)保及可再生資源利用等領(lǐng)域的酶制劑。

測(cè)定原理：

采用蒽酮比色法測(cè)定CL催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、濃硫酸和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體40mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存； 臨用前加入5mL蒸餾水和45mL濃硫酸充分溶解待用。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

加樣表和測(cè)定步驟：

37℃振蕩反應(yīng)1h后，90℃水浴15min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后

8000g 25℃離心10min，取上清，得糖化液

混勻， 90℃水浴10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，測(cè)620nm下吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

CL活力計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 5.018x - 0.0462；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、血清（漿）CL活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V反總]÷V樣÷T =39.8×(ΔA+0.0462)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中CL活力的計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.0796×(ΔA+0.0462)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.6mL； V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定回歸方程為y = 2.5090x - 0.0462；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、血清（漿）CL活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷2.509×V反總]÷V樣÷T =79.6×(ΔA+0.0462)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中CL活力的計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL活力(μg /min /mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462)÷2.509×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=79.6×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462)÷2.509×V反總]÷(W× V樣÷V樣總)÷T

=79.6×(ΔA+0.0462)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL活力(μg /min /104cell)=[1000×(ΔA+0.0462)÷2.509×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.1592×(ΔA+0.0462)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.6mL； V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

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