組織化學(xué):

1。石蠟切片染色程序:用二甲苯或其他清洗劑和分級(jí)酒精系列對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟和水化，在自來(lái)水中沖洗5分鐘。如果需要，檢索抗原使用抗原揭膜溶液(檸檬酸鹽為基礎(chǔ)，Cat。不。H-3300或tris型，Cat。不。h - 3301)。1 b。冷凍切片染色程序:風(fēng)干切片。染色前立即用丙酮固定切片。將片傳輸?shù)骄彌_區(qū)。如果內(nèi)源性酶活性存在，用適當(dāng)?shù)姆椒缁睢?/span>

2. 如果需要，使用鏈親和素/生物素阻斷試劑盒(Cat)進(jìn)行鏈親和素/生物素阻斷。不。sp - 2002)。Avidin/Biotin阻斷試劑盒(Cat.;不。SP-2001)是一種含有末端甘露糖殘基的糖蛋白。不建議使用親和素/生物素阻斷試劑盒，特別是當(dāng)使用甘露糖特異性凝集素時(shí)。

3.用carbofree™阻斷溶液(Cat)孵育片段阻斷非特異性結(jié)合。不。SP-5040)在室溫下放置30分鐘。從切片上吸去多余的堵塞溶液。

4. 在PBS (10 mM磷酸鈉，150 mM NaCl, pH 7.4)中加入約2-20 μg/ml的生物素化凝集素，在室溫下孵育30分鐘。用TPBS (PBS + 0.05% Tween®20)清洗。

5. 準(zhǔn)備VECTASTAIN®Elite®ABC-HRP (Cat)。不。PK-6100)或VECTASTAIN®ABC-AP (Cat;不。根據(jù)試劑盒說(shuō)明使用AK-5000)試劑。涂于切片上，室溫孵育30分鐘。用TPBS清洗。6. 為步驟5中使用的酶系統(tǒng)應(yīng)用適當(dāng)?shù)某恋淼孜铩?/span>對(duì)于過(guò)氧化物酶，impact®DAB (Cat。不。SK-4105);用于堿性磷酸酶，impact®Vector®Red (Cat;不。推薦使用SK-5105)。用自來(lái)水沖洗。7. 防污(可選)，清潔和安裝。

ELISA:

1。將50-200 μl約3 μg/ml的糖蛋白溶液放入所需孔中，將目標(biāo)蛋白吸附到微滴板上。有些井可能不進(jìn)行處理，作為負(fù)控制。37℃孵育1小時(shí)。用TPBS (PBS + 0.05% Tween 20)洗滌孔3次。

2. 阻斷非特異性結(jié)合，在室溫下用無(wú)碳水化合物阻斷溶液將每個(gè)孔填滿30分鐘。用TPBS洗三次井。在下面的程序中，試劑的體積為100 cm2膜的開(kāi)發(fā)進(jìn)行了優(yōu)化。體積可以按比例調(diào)整不同大小的印跡。

3.在PBS中加入50-200 μl約2-20 μg/ml的生物素化凝集素，室溫孵育30分鐘。用TPBS洗三次井。

4. 根據(jù)試劑盒說(shuō)明制備veectastain Elite ABC-HRP或veectastain ABC-AP試劑。涂于孔中，室溫孵育30分鐘。用TPBS洗三次井。

5. 為步驟4中使用的酶系統(tǒng)應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆浅恋淼孜铩?/span>對(duì)于過(guò)氧化物酶，TMB (Cat。不。推薦使用SK-4400)。6. 用分光光度法定量有色反應(yīng)產(chǎn)物。

Western Blot:

1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行電泳并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。

2. 室溫下，在無(wú)碳水化合物阻斷溶液中培養(yǎng)30分鐘，阻斷非特異性結(jié)合。使用足夠的體積來(lái)覆蓋薄膜。

3.在含有約2-20 μg/ml生物素化凝集素的PBS中室溫孵育膜30分鐘。用TPBS (PBS + 0.05% Tween 20)洗滌。

4. 根據(jù)試劑盒說(shuō)明制備veectastain Elite ABC-HRP或veectastain ABC-AP試劑。室溫下將膜在試劑中孵育30分鐘。用TPBS清洗。

5. 為步驟4中使用的酶系統(tǒng)應(yīng)用適當(dāng)?shù)牡孜铩?/span>對(duì)于過(guò)氧化物酶，DuoLuX®化學(xué)發(fā)光和熒光底物(過(guò)氧化物酶，Cat。不。SK-6604)或impact®DAB (Cat。不。sk - 4105)建議;堿性磷酸酶，化學(xué)發(fā)光和熒光底物(堿性磷酸酶，Cat。不。SK-6605)或BCIP/NBT(堿性磷酸酶，Cat。不。SK-5400)。僅供研究使用。不適用于動(dòng)物或人類的治療或診斷用途。

負(fù)控制:負(fù)控制應(yīng)該在上述每種方法中并行運(yùn)行，以驗(yàn)證綁定結(jié)果。當(dāng)應(yīng)用凝集素時(shí)，最合適的陰性對(duì)照之一是預(yù)先吸收凝集素與已知凝集素具有高親和力的特定糖的濃度。Vector Laboratories提供了一系列用于這一目的的糖。將凝集素在含有約200 - 500mm糖的溶液中稀釋到合適的工作濃度。該混合物在室溫下結(jié)合30至60分鐘。在吸收孵育之后，將混合物替換為未吸收的凝集素，并在相同條件下孵育。測(cè)試方法遵循后續(xù)檢測(cè)程序。在大多數(shù)情況下，絕大多數(shù)凝集素結(jié)合到組織切片(膜印跡等)將被消除。在這些條件下，一些與切片的痕量結(jié)合(印跡等)可能仍然存在，并且可能表明存在二級(jí)或三級(jí)糖偏好。這些陰性對(duì)照結(jié)果應(yīng)與試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，以確定結(jié)合的特異性。